Con el apoyo de los rebeldes portugueses y de las flotas de Francia y Holanda, el sobrino del todopoderoso valido del Rey organizó una conjura para crear un reino andaluz separado de Castilla en 1641
La conspiración secesionista de Andalucía fue un episodio a la sombra de la Sublevación de Portugal. Así, cuando dio comienzo la primera sublevación de Portugal en agosto de 1637, las operaciones para pacificar el Algarve le fueron encomendadas al IX duque de Medina Sidonia, en el ejercicio de sus funciones como Capitán General del Ejército de Andalucía. Y aunque esta primera rebelión fracasó, la pasividad de Medina-Sidonia volvió a repetirse en 1640. Frente a la rebelión general y la proclamación del Duque de Braganza como Rey de Portugal, Felipe IV y el Conde-Duque empezaron a preparar la reconquista de Portugal el 1 de diciembre de 1640. Para ello encomendaron al duque de Medina-Sidonia la capitanía general de un ejército que debía atacar a los rebeldes y derrocar a Juan II de Braganza. No obstante, la lentitud y falta de iniciativa del noble andaluz dejaron entrever sus planes ocultos. Tampoco ayudó el hecho de que la nueva Reina de Portugal, Luisa de Guzmán, fuera hermana del duque de Medina-Sidonia y, de hecho, quien había convencido a su marido Juan II de Braganza para que aceptara la Corona diciendo, según la tradición: «Más vale ser Reina por un día que duquesa toda la vida!».
Las razones detrás del intento de secesión andaluz serían meramente particulares –como de hecho ocurría en Cataluña y Portugal–, sin que hubiera ningún trasfondo nacionalista, dado que Andalucía había sido repoblada durante la Reconquista por colonos castellanos y no albergaba ambiciones de separarse de una estructura política, la Monarquía hispánica, donde Castilla jugaba un papel protagonista. Fue, en esencia, los caprichos de un arruinado duque de Medina-Sidonia que se oponía a contribuir a que su hermana perdiera la corona lusa y buscaban recuperar la gloria de su casa. Pese a la inmensa fortuna familiar de los Medina-Sidonia, las finanzas de la casa pasaban por dificultades y la mayoría de su patrimonio estaba hipotecado.
Al parecer, la primera idea del levantamiento andaluz partió del marqués de Ayamonte, Francisco Manuel Silvestre de Guzmán y Zúñiga –titular de una de las ramas menores de la casa de Medina-Sidonia–, quien convenció a su primo para coordinarse con Portugal y las flotas de Francia y Holanda, las cuales debían tomar el puerto clave de Cádiz, y sublevar Andalucía. Un espía de La Haya fue el primero en alertar a Felipe IV de lo que se gestaba en el sur de España. Las sospechas desde Madrid quedaron confirmadas cuando en el verano de 1641 uno de los hombres de confianza de Felipe IV, Antonio de Isasi, interceptó en la frontera con Portugal una carta remitida por Ayamonte a Medina-Sidonia en la que quedaba al descubierto la trama de la conspiración. Los «guzmanes» (llamados así por el apellido) fueron llamados a la Corte, pero el duque se excusó alegando razones de salud mientras conseguía tiempo para que acudiera la flota franco-holandesa a las costas portuguesas.
Medina-Sidonia se salva de la ejecución
La flota nunca hizo acto de presencia y todos los nobles castellanos sondeados se negaron a participar en una temeraria empresa que ni siquiera contaba con el apoyo de las clases populares. Sin que hubiera prendido todavía el levantamiento, Luis de Haro y Guzmán –el gran protegido del Conde-Duque– se presentó con presteza en Andalucía a conocer el alcance de la conjura y a detener a Medina-Sidonia. El duque andaluz escapó a tiempo hacia Madrid para dar explicaciones en persona a su pariente el Conde-Duque. El hecho de que los principales cabecillas estuvieran emparentados con el valido amenazaba con complicar todavía más el asunto y con generar un conflicto de intereses, pero nada más lejos de la realidad. El Conde-Duque persuadió a su sobrino para que confesara la conspiración a cambio de inmunidad, cuando en realidad no tenía la menor intención de usar su poder para proteger al responsable de una acción tan grave.Pese a ello, la debilidad de la Monarquía hispánica quedó retratada cuando en un primer momento pareció que el único castigo lo iba a sufrir el marqués de Ayamonte. El marqués fue interrogado en Illescas y confinado en el Alcázar de Segovia. En los interrogatorios se declaró culpable cargando, no en vano, la mayor parte de la responsabilidad en el duque, a quien dijo haber advertido de que no le permitiría proclamarse Rey de Andalucía y que solo le apoyaría en la formación de una república andaluza. Tras un prolongado juicio, el marqués de Ayamonte fue condenado a la confiscación de sus bienes y a la pena de muerte. Si bien durante un tiempo se sopesó computar la pena de muerte por la cadena perpetua, la conspiración aragonesa del duque de Híjar en 1648 hizo necesario un castigo ejemplar para que no siguieran reproduciéndose actos de rebelión entre la nobleza. Ayamonte fue ejecutado en el Alcázar de Segovia, siendo degollado como correspondía a los traidores a la Corona.
El Rey perdonó la vida al Duque de Medina por su alto rango, aunque tuvo que pagar una multa de doscientos mil ducados como donativo a la Corona y sufrió el destierro de sus dominios andaluces. Solo cuando violó estas prohibiciones en 1642, coincidiendo con la presencia de una flota franco-holandesa en las proximidades de Cádiz, fue arrestado y encarcelado en el castillo de Coca. En 1645 se le privó del Señorío de Sanlúcar, que revirtió a la Corona, y de la Capitanía General del Mar Océano y Costas de Andalucía, que pasó a su rival el duque de Medinaceli. En un desesperado intento por lavar su imagen, Medina-Sidonia tuvo la estrafalaria idea de retar a duelo al Rey de Portugal. Le convocó a comparecer en Badajoz, erca de Valencia de Alcántara, donde se desplazó el duque y su séquito, que esperó inútilmente ochenta días a la comparecencia del soberano.